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细菌的分离纯化
添加时间:2017-03-16 点击量:

划线分离:制备果胶酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取具有水解圈的菌种,****次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是:先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火焰上方(注意:不能离火焰太近)打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放;

纯种保藏:再配制一份普通细菌培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。

a) 纯种果胶酶水解能力的测定

配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,将分离纯化的细菌点种于平板上(注意:点种的量不宜过多,以3~4个为宜),在30℃培养箱中培养1~2天,取培养后的平皿用0.5%的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,测量并记录透明圈的大小

b) 简单染色步骤

i. 涂片

取一块载玻片,在上边用胶头滴管加半滴无菌水,用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹,待看到微弱的浑浊即可;(注意取菌不要太多)

ii. 干燥与固定

涂菌面朝上,通过火焰以干燥并固定菌物,固定过程应使载玻片通过火焰2-3次,注意温度的控制,过热的温度会将细菌杀死,温度以手背感觉微微发烫为标准;

iii. 染色

将载玻片平放于载波片支架上,滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可,染色1.5min

iv. 水洗

倾去染液,将载玻片的涂菌面朝下,自来水冲洗,水流不宜太急、太大,至洗出水无色为止;

v. 干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥;

vi. 镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌的形态。

c) 革兰氏染色步骤

i. 涂片

先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域,在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种(大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和一种自选菌)按常规方法涂片(不宜过厚),用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。

ii. 初染

滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位,染色1.5min后水洗;

iii. 媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min后水洗;

iv. 脱色

先用乙醇冲去水迹,然后用95%乙醇覆盖脱去色素,脱色约30s,立即用水冲洗;

v. 复染

先用番红洗去水迹,然后滴加番红复染1.5min后水洗;

vi. 镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照,来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。

d) 芽孢染色步骤

i. 涂片,加热干燥及固定

在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水,分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定;

ii. 孔雀绿加热染色

用木夹夹住载玻片,向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位,然后在酒精灯上微微加热(孔雀绿着色能力强,加热可使较难染色的芽孢染成绿色,且再难洗脱)至染液冒蒸汽开始计时并维持5min,注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜,过热或加热不足均会影响观察效果,且加热时在载玻片上随时补加染液,切勿让涂片干涸;

iii. 水洗

水洗一定要等载玻片冷却后进行,否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行;

iv. 复染

用0.5%番红水溶液复染2min;

v. 水洗并干燥

按常规方法水洗后自然干燥;

vi. 镜检

先在低倍镜下寻找视野范围,然后换用高倍镜调焦,最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。

e) 半固体穿刺法观察细菌运动性

i. 配制培养基

配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内,110度灭菌20-30分钟,正立于烧杯中冷却至室温;

ii. 在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出。如图所示: 

iii. 接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。

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